Real-Time PCR
실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 target DNA의 양을 분석하는 실험방법입니다. 이 실험법의 장점은 End-point PCR과 달리 전기영동 과정이 필요 없이 신속하고 간편하게 확인이 가능하며, 민감도와 특이도가 높아 보다 정밀하게 분석이 가능합니다.
<Real time PCR vs. 일반 PCR>
| | End-point PCR | Real-Time PCR |
| 결과분석 | 전기영동 및 Gel Doc | Real-Time PCR 장비 |
| 정량분석 | 낮은 수준의 정량 | 높은 수준의 정량 |
| 실험시간 | 2시간 30분 이상 | 1시간 30분 미만 |
| 금액대 | 상대적 저가 | 상대적 고가 |
1. Real-Time PCR 원리
1) SYBR Green (Intercalator type)
형광물질인 SYBR Green 또는 기타 dye등을 intercalator로서 사용하는 실험 방법입니다.
SYBR Green은 PCR에 의해서 합성된 double strand DNA에 결합해 형광을 나타나게 됩니다. 이 형광량을 측정하여 증폭된 산물의 양을 측정할 수 있습니다.
2) Probe
Probe의 5’에는 형광물질, 3’에는 형광을 억제하는 quencher가 붙어 있습니다.Extension단계에서 probe가 깨지면서 형광물질이 quencher로부터 분리되어 형광을 나타나게 됩니다. 이 형광량을 측정하여 증폭된 산물의 양을 측정할 수 있습니다.
<SYBR Green vs. Probe>
| | SYBR Green | Probe |
| 감도 | 가변적* | low copies |
| 특이성 | 보통 | 높음 |
| Melting curve analysis* | 가능 | 불가능 |
| Multiplex | 불가능 | 가능 |
| Primer/probe design | 쉬움 | 어려움 |
| 금액대 | 상대적 저가 | 상대적 고가 |
* 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다.
* Melting Curve: DNA double strand가 denaturation되면서 SYBR Green형광 값이 변화되는 것을 나타내는 그래프입니다. DNA size에 따른 denaturation 온도가 다른 점을 이용하여 단일 PCR product인지 확인할 수 있습니다.
2. 정량분석 (Quantitation Analysis)
1) 절대정량 (Absolute Quantitation)
농도를 알고 있는 DNA의 Ct값을 기준으로 알고자 하는 Target DNA의 Ct값을 비교하여 정량하는 방법입니다. 결과 분석을 위해서는 Standard curve가 필요합니다.
2) 상대정량 (Relative Quantitation)
다른 조건의 샘플에 의한 특정 유전자 발현의 변화 또는 차이를 분석하는 방법입니다. 결과 분석을 위해서 reference gene이 필요하며 유전자 발현 분석에 이용되고 있습니다.
<다양한 분석을 위한 Real-Time PCR system의 curves>
3. GenDEPOT 제품 정보
1) 사용 가능한 장비
Passive reference dye는 농도, volume의 변화나 장비의 scanner차이로부터 보정하기 위해 reporter dye 신호를 normalization하는 역할을 합니다.
GenDEPOT 제품은 호환 장비에 따라 Passive reference dye가 포함되어 별도로 추가할 필요가 없습니다.
- ROX reference dye
: 일반적인 Real-time장비(예시: ABI사 장비)에서 사용되는 passive reference dye
- Fluorescein reference dye
: Bio-rad사의 iCycler, iQ 장비에서 사용되는 passive reference dye
| Product | Cat. No | Size | 사용 가능한 장비 |
| amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix (2x), w/o ROX | Q5600-005 | 5 x 1 ml | Bio-rad: CFX96/384
Eppendorf: Mastercycler
QIAGEN: Rotor-Gene Q
Roche: LightCycler 96/480/1536
TakaRa: Thermal Cycler Dice |
| amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix (2x), Fluorescein | Q5601-005 | 5 x 1 ml | Bio-rad: iCycler iG/iQ5, MyiQ |
| amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix (2x), High ROX (100mM) | Q5602-005 | 5 x 1 ml | ABI: Prism 7000/7700/7900 HT, 5700, 7300, StepOne, StepOne Plus |
| amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix (2x), Low ROX (10mM) | Q5603-005 | 5 x 1 ml | ABI: 7500, ViiA 7, QuantiStudio 3, 5, 12K |
2) 오염방지 (Contamination prevention)
UDG (Uracil DNA Glycosylase)
PCR template가 cross contamination에 의해 false positive이 생기는 경우가 있습니다. 이러한 오염을 방지하기 위해 GenDEPOT의 amfiSure qGreen 제품은 UDG가 포함되어 있습니다. UDG는 오염된 반응액만을 특이적으로 분해하여 신뢰성이 있는 결과를 얻을 수 있습니다.
(A)와 (B) template에 UDG를 적용하면 다음과 같습니다.
① (A) template의 PCR 준비
: (A) template에 dUTP, UDG, dNTP, taq polymerase를 첨가합니다.
② (A) template의 PCR
: dT 대신 dU가 amplicon을 합성합니다.
③ (B) template의 PCR 준비
: (B) template도 ①번과 동일하게 PCR을 준비합니다.
④ UDG 처리 (dU로 합성된 DNA 제거)
: (B) template를 PCR 실행 전에 UDG(Uracil-DNA-Glycosylase)를 activation(50℃, 2분) 및 inactivation(95℃, 3분)을 합니다.
이전에 dU와 합성된 PCR 반응물(A template)이 분해됩니다.
④ (B) template의 PCR
: UDG 처리 후, PCR 진행하면 (B) template만 증폭됩니다. 위의 과정을 다른 샘플에 적용하면 이전 PCR반응물의 교차오염을 방지하게 됩니다.
3) amfiSure qGreen 사용 시, 주의사항
① 사용 중인 Real-time PCR 장비와 호환되는 시약을 선택해주시기 바랍니다.
② 각 장비에 맞는 passive reference dye가 PCR Master Mix에 포함되어 있습니다.
③ 최적의 정량적인 결과를 위해서, genomic DNA 50μg 또는 plasmid DNA 10ng까지 사용합니다. 또한, cDNA의 volume은 최종 PCR volume의 10%를 초과하지 않습니다. (예를 들어, 최종 PCR산물이 20μl이면, 희석하지 않은 cDNA 2μl를 사용합니다.)
④ PCR 준비 시, 각 구성품을 모두 첨가한 후 거품이 발생하지 않도록 주의합니다. 거품이 있다면, PCR 중 형광 신호 검출에 방해될 수 있습니다.
⑤ PCR 수행 시, initial denaturation는 95℃, 3분 / denaturation은 95℃, 10초로 설정해주시기 바랍니다. Denaturation이 잘 진행되어야 amplicon이 제대로 증폭할 수 있습니다.
※ Real-Time PCR 실험 시, 필수 정보
1) Primer 디자인
① NCBl의 primer-Blast (사이트 가기)
NCBI의 Primer-Blast 이용 방법
② Pre-designed Primer (QIAGEN 제품 보러가기)
* 제품 문의 T. 031-728-3235, E. technical@dawinbio.com
#GenDEPOT #진디포 #RT-qPCR #qPCR #RTPCR #qGreen #amfisure #sybrgreen #rox
쇼핑몰 바로 가기
Real-Time PCR
실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 target DNA의 양을 분석하는 실험방법입니다. 이 실험법의 장점은 End-point PCR과 달리 전기영동 과정이 필요 없이 신속하고 간편하게 확인이 가능하며, 민감도와 특이도가 높아 보다 정밀하게 분석이 가능합니다.
<Real time PCR vs. 일반 PCR>
1. Real-Time PCR 원리
1) SYBR Green (Intercalator type)
형광물질인 SYBR Green 또는 기타 dye등을 intercalator로서 사용하는 실험 방법입니다.
SYBR Green은 PCR에 의해서 합성된 double strand DNA에 결합해 형광을 나타나게 됩니다. 이 형광량을 측정하여 증폭된 산물의 양을 측정할 수 있습니다.
2) Probe
Probe의 5’에는 형광물질, 3’에는 형광을 억제하는 quencher가 붙어 있습니다.Extension단계에서 probe가 깨지면서 형광물질이 quencher로부터 분리되어 형광을 나타나게 됩니다. 이 형광량을 측정하여 증폭된 산물의 양을 측정할 수 있습니다.
<SYBR Green vs. Probe>
* 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다.
* Melting Curve: DNA double strand가 denaturation되면서 SYBR Green형광 값이 변화되는 것을 나타내는 그래프입니다. DNA size에 따른 denaturation 온도가 다른 점을 이용하여 단일 PCR product인지 확인할 수 있습니다.
2. 정량분석 (Quantitation Analysis)
1) 절대정량 (Absolute Quantitation)
농도를 알고 있는 DNA의 Ct값을 기준으로 알고자 하는 Target DNA의 Ct값을 비교하여 정량하는 방법입니다. 결과 분석을 위해서는 Standard curve가 필요합니다.
2) 상대정량 (Relative Quantitation)
다른 조건의 샘플에 의한 특정 유전자 발현의 변화 또는 차이를 분석하는 방법입니다. 결과 분석을 위해서 reference gene이 필요하며 유전자 발현 분석에 이용되고 있습니다.
<다양한 분석을 위한 Real-Time PCR system의 curves>
3. GenDEPOT 제품 정보
1) 사용 가능한 장비
Passive reference dye는 농도, volume의 변화나 장비의 scanner차이로부터 보정하기 위해 reporter dye 신호를 normalization하는 역할을 합니다.
GenDEPOT 제품은 호환 장비에 따라 Passive reference dye가 포함되어 별도로 추가할 필요가 없습니다.
- ROX reference dye
: 일반적인 Real-time장비(예시: ABI사 장비)에서 사용되는 passive reference dye
- Fluorescein reference dye
: Bio-rad사의 iCycler, iQ 장비에서 사용되는 passive reference dye
Eppendorf: Mastercycler
QIAGEN: Rotor-Gene Q
Roche: LightCycler 96/480/1536
TakaRa: Thermal Cycler Dice
2) 오염방지 (Contamination prevention)
UDG (Uracil DNA Glycosylase)
PCR template가 cross contamination에 의해 false positive이 생기는 경우가 있습니다. 이러한 오염을 방지하기 위해 GenDEPOT의 amfiSure qGreen 제품은 UDG가 포함되어 있습니다. UDG는 오염된 반응액만을 특이적으로 분해하여 신뢰성이 있는 결과를 얻을 수 있습니다.
(A)와 (B) template에 UDG를 적용하면 다음과 같습니다.
① (A) template의 PCR 준비
: (A) template에 dUTP, UDG, dNTP, taq polymerase를 첨가합니다.
② (A) template의 PCR
: dT 대신 dU가 amplicon을 합성합니다.
③ (B) template의 PCR 준비
: (B) template도 ①번과 동일하게 PCR을 준비합니다.
④ UDG 처리 (dU로 합성된 DNA 제거)
: (B) template를 PCR 실행 전에 UDG(Uracil-DNA-Glycosylase)를 activation(50℃, 2분) 및 inactivation(95℃, 3분)을 합니다.
이전에 dU와 합성된 PCR 반응물(A template)이 분해됩니다.
④ (B) template의 PCR
: UDG 처리 후, PCR 진행하면 (B) template만 증폭됩니다. 위의 과정을 다른 샘플에 적용하면 이전 PCR반응물의 교차오염을 방지하게 됩니다.
3) amfiSure qGreen 사용 시, 주의사항
① 사용 중인 Real-time PCR 장비와 호환되는 시약을 선택해주시기 바랍니다.
② 각 장비에 맞는 passive reference dye가 PCR Master Mix에 포함되어 있습니다.
③ 최적의 정량적인 결과를 위해서, genomic DNA 50μg 또는 plasmid DNA 10ng까지 사용합니다. 또한, cDNA의 volume은 최종 PCR volume의 10%를 초과하지 않습니다. (예를 들어, 최종 PCR산물이 20μl이면, 희석하지 않은 cDNA 2μl를 사용합니다.)
④ PCR 준비 시, 각 구성품을 모두 첨가한 후 거품이 발생하지 않도록 주의합니다. 거품이 있다면, PCR 중 형광 신호 검출에 방해될 수 있습니다.
⑤ PCR 수행 시, initial denaturation는 95℃, 3분 / denaturation은 95℃, 10초로 설정해주시기 바랍니다. Denaturation이 잘 진행되어야 amplicon이 제대로 증폭할 수 있습니다.
※ Real-Time PCR 실험 시, 필수 정보
1) Primer 디자인
① NCBl의 primer-Blast (사이트 가기)
NCBI의 Primer-Blast 이용 방법
② Pre-designed Primer (QIAGEN 제품 보러가기)
* 제품 문의 T. 031-728-3235, E. technical@dawinbio.com
#GenDEPOT #진디포 #RT-qPCR #qPCR #RTPCR #qGreen #amfisure #sybrgreen #rox
쇼핑몰 바로 가기