Western Blot
Western blot은 전기영동법을 이용해 단백질을 크기 별로 분리한 다음, 항원-항체 반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질을 검색하는 실험기법입니다. 주로 특정 단백질의 유무, 양, 또는 단백질의 발현 여부나 정도를 확인하기 위해 사용하는 실험 기법으로 항원-항체 반응을 이용하기 때문에 특이성이 높으며, Enzyme-Substrate 반응에 의한 Detection으로 확인합니다.
1. Sample Lysis
① Lysis buffer에 protease inhibitor를 1X로 희석하여 준비합니다.
② Mammalian cell인 경우, ①번 buffer를 넣고 분리합니다.
Tissue인 경우, ①번 buffer에 넣고 homogenizer 또는 sonicator을 이용해 protein 분리합니다.
③ Sample을 spin-down 시킨 후 상층액만 분리하여 실험에 사용합니다.
④ Bradford 또는 BCA protein assay kit를 이용하여 추출된 protein의 양을 확인합니다.
⑤ 동일한 양의 protein에 sample buffer를 넣고 100℃에서 5분간 boiling 합니다.
Protein 종류에 따른 Buffer Recommendation Guide
| Sample Type | Lysis Buffer |
| Whole cell | NP-40 또는 RIPA |
| Cytoplasmic (soluble) | Tris-HCl |
| Cytoplasmic (cytoskeletal bound) | Tris-Triton |
| Membrane bound | NP-40 또는 RIPA |
| Nuclear | RIPA 또는 nuclear fraction protocol |
| Mitochondria | RIPA 또는 mitochondria fraction protocol |
Ordering information
| Category | Product | Cat. No. | Size | 국내 재고 |
| Lysis Buffer | RIPA Cell Lysis Buffer (1X) with EDTA | R4100-010 | 100 ml |  바로 구매 |
| RIPA II Cell Lysis Buffer with Triton (1X), without EDTA | R4200-010 | 100 ml |  바로 구매 |
Protease/Phosphatase
Inhibitor Cocktail Solution | Xpert Protease Inhibitor Cocktail Solution (100X) | P3100-001 | 1 ml |  바로 구매 |
| Xpert Phosphatase Inhibitor Cocktail Solution (100X) | P3200-001 | 1 ml |  바로 구매 |
| Xpert Duo Inhibitor Cocktail Solution (100X) | P3300-001 | 1 ml |  바로 구매 |
| Protein Agarose | Puredown Protein A-Agarose, BSA-Binding Site Blocked | P9201-015 | 1.5 ml |
|
| Puredown Protein G-Agarose, BSA-Binding Site Blocked | P9202-015 | 1.5 ml |
|
| Puredown Protein A/G-Agarose, BSA-Binding Site Blocked | P9203-015 | 1.5 ml |
|
Protein
Quantification (정량) | Bradford (Coomassie) Protein Assay Plus Kit | P7200-050 | Kit |  바로 구매 |
| Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | P8100-050 | Kit |  바로 구매 |
| Protein Sample Buffer | Laemmli Sample Buffer (4X), Reducing | L1100-001 | 10 ml |  바로 구매 |
| Laemmli Sample Buffer (4X), Non-Reducing | L1200-001 | 10 ml |  바로 구매 |
| Native Sample Buffer (4X) | N2300-002 | 20 ml |  바로 구매 |
2. SDS-PAGE
① Acryamide, SDS, Tris, TEMED, APS를 적정농도로 혼합하여 gel을 만듭니다.
* 분리하고자 하는 Protein size에 따라 gel의 농도를 선택합니다.
② Gel이 준비되면 각 well에 20-30 μg의 동일한 양의 sample을 loading 합니다.
③ 첫번째 또는 마지막 well에는 Xpert Protein Marker를 loading 합니다.
④ 1X로 희석하여 준비해둔 running buffer를 넣어주고 100-150V에서 50-90분 정도 전기영동 합니다.
⑤ 전기영동이 잘 되었는지 확인하기 위하여 gel을 ProsiBlue Gel Staining 또는 coomassie blue staining Solution으로 확인합니다.
Gel Selection Guide
| Gel percentage (%) | Protein Size (kDa) |
| 20 | 4 - 40 |
| 15 | 12 - 45 |
| 12.5 | 10 - 70 |
| 10 | 15 - 100 |
| 8 | 25 - 200 |
Acrylamide : Bis-acrylamide
| Ratio | Application |
| 19 : 1 | Sequencing Nucleic Acid |
| 29 : 1 | Nucleic Acid Separation |
| 37.5 : 1 | Protein Electrophoresis |
Ordering information
| Category | Product | Cat. No. | Size | 국내 재고 |
| SDS- PAGE Gel | Acrylamide : bis 30%, 29:1 Solution | A0418-050 | 495 ml |
|
| Acrylamide : bis 40%, 29:1 Solution | A0421-050 | 495 ml |
|
| 1.5M Tris-HCl Buffer (pH 8.8) | T8101-050 | 500 ml |  바로 구매 |
| 0.5M Tris-HCl Buffer (pH 6.8) | T8102-050 | 500 ml |  바로 구매 |
| 10％ SDS Solution | S0792-050 | 500 ml |  바로 구매 |
| 20％ SDS Solution | S0793-050 | 500 ml |  바로 구매 |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets, 150 mg | A7503-020 | 20 Tablets |  바로 구매 |
| TEMED | T0512-002 | 25 ml |  바로 구매 |
| Running Buffer | Tris, Ultra Pure | T9200-100 | 1 Kg |  바로 구매 |
| Glycine, 99％ | G0610-100 | 1 Kg |  바로 구매 |
| SDS, 99％ Ultra Pure | S0800-100 | 1 Kg |
|
| 10X Tris-Glycine SDS buffer (Running buffer) | T8053-050 | 500 ml |  바로 구매 |
| Protein Marker | Prosi Prestained Protein Marker | P8500-040 | 2 X 200 μl |  바로 구매 |
| Xpert Prestained Protein Marker | P8502-050 | 2 X 250 μl |  바로 구매 |
| Xpert 2 Prestained Protein Marker | P8503-050 | 2 X 250 μl |  바로 구매 |
| Gel Staining | ProsiBlue Gel Staining Solution | P7300-050 | 500 ml |
|
3. (Wet) Transfer
① 전기영동이 끝난 gel을 (+) Sponge - Filter paper - Membrane - Gel - Filter paper - Sponge (-) 순서로 넣어 장치에 넣습니다.
* PVDF membrane의 경우, 높은 순도의 Methanol로 pre-wetting (activation) 1-2분간 incubation 후 차가운 transfer buffer로 5분간
incubation합니다. Gel을 PVDF의 매끄러운 면에 맞닿도록 올려 놓습니다.
② 미리 1X로 희석해둔 transfer buffer에 사용 전 methanol을 넣은 후 100V에서 60-120분간 transfer합니다.
③ Transfer가 잘 되었는지 확인하기 위하여 membrane을 Ponceau S Solution으로 확인합니다.
Ordering information
| Category | Product | Cat. No. | Size | 국내 재고 |
| Transfer Membrane | West-Q PVDF Membrane, Roll, 0.22 um, 270mm x 3M | W7031-270 | Roll |
|
| West-Q PVDF Membrane, Roll, 0.45 um, 270mm x 3M | W7032-270 | Roll |
|
| NitroPure Nitrocellulose Transfer Membrane,Roll, 0.22 um , 300mm x 3M | LC7033-300 | Roll |
|
| NitroPure Nitrocellulose Transfer Membrane,Roll, 0.45 um , 300mm x 3M | LC7034-300 | Roll |
|
| Transfer Buffer | 10X Tris-Glycine Native Buffer (Transfer buffer) | T8052-050 | 500 ml |
|
| Membrane Staining | Ponceau S Solution | P9100-010 | 100 ml |
|
4. Western Blot
① Transfer가 완료된 membrane을 5% skim milk 또는 BSA에 1-2시간 정도 incubation 합니다(blocking).
② Washing 후 적정 농도로 희석된 primary antibody를 4℃에서 overnight하거나 RT에서 4 시간 동안 incubation 합니다.
③ Membrane washing후 희석된 secondary antibody를 1-2시간 상온에서 incubation 합니다.
Ordering information
5. Detection
① ECL solution의 A, B solution을 1:1 비율로 혼합하여 membrane에 분주합니다.
② X-ray film 또는 이미지 장비(Chemi Doc)를 이용하여 결과를 확인 합니다.
Ordering information
| Category | Product | Cat. No. | Size | 국내 재고 |
| ECL | West-Q Chemiluminescent Substrate Kit, Plus | W3651-012 | 120 ml |  바로 구매 |
| West-Q Pico ECL Solution | W3652-020 | 200 ml |  바로 구매 |
West-Q Pico Dura ECL Solution  | W3653-020 | 200 ml |  바로 구매 |
| West-Q Femto Clean ECL Solution | W3680-010 | 100 ml |  바로 구매 |
West-Q ECL Selection guide
| Product | Cat No. | 제품 특징 | Detection Range |
| West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit | W3651 | 높은 민감도 & 안정적인 시그널
경제적인 가격 | Picogram |
| West-Q Pico ECL Solution | W3652 | 높은 민감도 & 안정적인 시그널
낮은 백그라운드 | Low Picogram |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | W3653 | 높은 민감도 & 안정적인 시그널
뛰어난 시그널 지속성 | Low Picogram |
| West-Q Femto Clean ECL Solution | W3680 | 매우 높은 민감도 & 안정적인 시그널
매우 낮은 백그라운드 | Femtogram |
* Sample 신청 가능합니다. (Click!)
제품 문의 T. 031-728-3235 E. technical@dawinbio.com
#GenDEPOT #진디포 #Protein #WesternBlot #WB
Western Blot
Western blot은 전기영동법을 이용해 단백질을 크기 별로 분리한 다음, 항원-항체 반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질을 검색하는 실험기법입니다. 주로 특정 단백질의 유무, 양, 또는 단백질의 발현 여부나 정도를 확인하기 위해 사용하는 실험 기법으로 항원-항체 반응을 이용하기 때문에 특이성이 높으며, Enzyme-Substrate 반응에 의한 Detection으로 확인합니다.
1. Sample Lysis
① Lysis buffer에 protease inhibitor를 1X로 희석하여 준비합니다.
② Mammalian cell인 경우, ①번 buffer를 넣고 분리합니다.
Tissue인 경우, ①번 buffer에 넣고 homogenizer 또는 sonicator을 이용해 protein 분리합니다.
③ Sample을 spin-down 시킨 후 상층액만 분리하여 실험에 사용합니다.
④ Bradford 또는 BCA protein assay kit를 이용하여 추출된 protein의 양을 확인합니다.
⑤ 동일한 양의 protein에 sample buffer를 넣고 100℃에서 5분간 boiling 합니다.
Protein 종류에 따른 Buffer Recommendation Guide
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Inhibitor Cocktail Solution
Quantification (정량)
2. SDS-PAGE
① Acryamide, SDS, Tris, TEMED, APS를 적정농도로 혼합하여 gel을 만듭니다.
* 분리하고자 하는 Protein size에 따라 gel의 농도를 선택합니다.
② Gel이 준비되면 각 well에 20-30 μg의 동일한 양의 sample을 loading 합니다.
③ 첫번째 또는 마지막 well에는 Xpert Protein Marker를 loading 합니다.
④ 1X로 희석하여 준비해둔 running buffer를 넣어주고 100-150V에서 50-90분 정도 전기영동 합니다.
⑤ 전기영동이 잘 되었는지 확인하기 위하여 gel을 ProsiBlue Gel Staining 또는 coomassie blue staining Solution으로 확인합니다.
Gel Selection Guide
Acrylamide : Bis-acrylamide
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3. (Wet) Transfer
① 전기영동이 끝난 gel을 (+) Sponge - Filter paper - Membrane - Gel - Filter paper - Sponge (-) 순서로 넣어 장치에 넣습니다.
* PVDF membrane의 경우, 높은 순도의 Methanol로 pre-wetting (activation) 1-2분간 incubation 후 차가운 transfer buffer로 5분간
incubation합니다. Gel을 PVDF의 매끄러운 면에 맞닿도록 올려 놓습니다.
② 미리 1X로 희석해둔 transfer buffer에 사용 전 methanol을 넣은 후 100V에서 60-120분간 transfer합니다.
③ Transfer가 잘 되었는지 확인하기 위하여 membrane을 Ponceau S Solution으로 확인합니다.
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4. Western Blot
① Transfer가 완료된 membrane을 5% skim milk 또는 BSA에 1-2시간 정도 incubation 합니다(blocking).
② Washing 후 적정 농도로 희석된 primary antibody를 4℃에서 overnight하거나 RT에서 4 시간 동안 incubation 합니다.
③ Membrane washing후 희석된 secondary antibody를 1-2시간 상온에서 incubation 합니다.
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5. Detection
① ECL solution의 A, B solution을 1:1 비율로 혼합하여 membrane에 분주합니다.
② X-ray film 또는 이미지 장비(Chemi Doc)를 이용하여 결과를 확인 합니다.
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West-Q ECL Selection guide
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매우 낮은 백그라운드
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#GenDEPOT #진디포 #Protein #WesternBlot #WB